Peternakan kambing berperan penting demi tercapainya ketahanan pangan melalui produksi daging dan susu. persilangan antara kambing senduro dan etawa diklaim merupakan kambing lokal super penghasil susu dan daging. Gen melanocortin receptor type 4 (MC4R) memiliki peranan penting dalam aktifitas neuron, adrenal, dan fungsi tiroid, serta sebagai mediator leptin dalam keseimbangan energi. Gen ini berlokasi pada kromosom nomor 24 dan terdiri dari 1 ekson. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kualitas semen dari kambing persilangan etawa dan senduro.
Pada penelitian ini menggunakan sampel semen kambing jantan berusia 3-5 tahun di Inseminasi Buatan Bogasari. Penelitian ini telah dinyatakan etis oleh komisi etik hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga dengan No:1.KEH.085.07.2022. Pengumpulan data termasuk penyimpanan semen, pemeriksaan kualitas semen, dan evaluasi PCR. Kualitas semen yang diperoleh dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan Motilitas semen dinilai pada kondisi segar, sebelum dan setelah pembekuan.
Sampel DNA yang digunakan merupakan semen sebelum freezing dan semen beku dari persilangan kambing etawa dan senduro. Sebelum ekstraksi, semen beku di thawing pada suhu 37 C selama 30 detik. Ekstraksi DNA menggunakan Thermo K-182001 Invitrogen Purelink Genomic DNA Minikir, 200 μl semen dimasukkan dalam tabung bervolume 1,5 ml dan ditambahkan dengan 20 μl K-proteinase dan 20 μl RNAse lalu dicampur rata dan dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu 60 C. setelah inkubasi, ditambahkan 200 μl etanol absolut dan dihomogenisasikan.
Larutan dipindahkan kedalam Purelink Spin Cloumn dan dicentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Tambahkan 400 μl buffer (W1) dan centrifuge kembali selama 30 detik pada kecepatan 10.000 rpm. kemudian tambahkan kembali 600 μl buffer (W2) dan centrifuge selama 30 detik pada kecepatan 10.000 rpm. Lalu dilakukan centrifuge kembali untuk terakhir kalinya selama 3 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Pindahkan larutan dalam tube bervolume 1,5 ml dan tambahkan 100-200 μl buffer elution. Kemudian centrifuge kembali selama 30 detik dengan kecepatan 10.000 rpm. Hasil ekstraksi DNA dimasukkan dalam tabung berukuran 1,5 ml dan dilabel. Kemudian disimpan dalam kulkas pendingin pada suhu -20 C untuk pemeriksaan selanjutnya.
PCR digunakan untuk mengamplifikasi fragmen spesifik DNA dari Gen MC4R. 20 μl larutan reaksi terdiri atas 12,6 μl PCR master mix, 1,6 μl dNTP, 2 μl 10x buffer, 0,2 μl Taq polymerase, 0,8 μl dan 2 μl forward dan reverse primer. Primer yang digunakan mengacu pada penelitian Latifah et al., 2017. Evaluasi PCR dimulai dari denaturasi, penguatan, pemanjangan, dan ekstensi terakhir. Amplifikasi in vitro menggunakan mesin thermal pada suhu 94 C selama 45 detik. Primer attchment terjadi pada suhu 57 C selama 45 detik, elongasi DNA baru terjadi pada suhu 72 C selama 1 menit, dan final elongasi terjadi pada suhu 72 C selama 5 menit.
Visualisasi hasil isolasi DNA dengan elektroforesis menggunakan 1,5% gel agarose dan SYBR dye. Elektroforesis akan menampakkan hasil berupa formasi pita yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan nomor pada setiap segmen dasarnya. Observasi hasil elektroforesis menggunakan Geldoc.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan volume, warna dan pH dari semen kambing peranakan etawa dan senduro. Volume semen dan frekuensi ejakulasi dari kedua kambing ini dipengaruhi oleh musim dan kelembaban. Volume semen kambing akan lebih tinggi pada musim panas.
Hasil pemeriksaan makroskopis menunjukkan semen kambing peranakan etawah berwarna putih kekuningan dengan konsistensi pekat dan berbau khas semen normal. Pada hasil pemeriksaan makroskopis semen kambing senduro nampak berwarna putih dengan konsistensi pekat dan memiliki bau semen yang normal. pH semen kambing normal berkisar antara 5,9 – 7,3. Hasil pemeriksaan semen kambing peranakan ettawa menunjukkan pH 6,4 dan semen kambing senduro menunjukkan pH 6,6, semuanya tegolong normal.
Kambing Senduro memiliki konsentrasi spermatozoa yang lebih tinggi dibanding kambing persilangan Etawa. Konsentrasi Spermatozoa juga dipengaruhi oleh musim dan kelembaban. Pada musim hujan, konsentrasi semen lebih tinggi dibandingkan musim panas dengan abnormalitas semen tidak lebih dari 20 %. Berdasarkan SNI 4869.3 2014, hanya semen segar dengan motilitas spermatozoa lebih dari 70% yang memenuhi syarat untuk dibekukan sehingga semen segar kambing Peranakan Etawa dan Senduro telah memenuhi syarat.
Perubahan suhu yang ekstrim selama proses pembekuan akan menyebabkan kristal es dan perubahan konsentrasi elektrolit sehingga menyebabkan kerusakan pada sel spermatozoa. Pencairan semen pada suhu 37 C selama 30 detik memiliki motilitas terbaik dibanding pada suhu 35 C selama 40 detik. Motilitas semen beku kambing pasca thawing menurut SNI 4869.3 2014 adalah minimal 40% sehingga kualitas semen beku pasca thawing kambing peranakan Etawa dan kambing Senduro masih layak digunakan untuk inseminasi buatan dan produksi embrio secara in vitro.
Evaluasi PCR terdiri dari amplifikasi fragmen DNA spesifik yang memiliki panjan pita spesifik untuk setiap spesies. Gen MC4R telah terdeteksi pada semua sampel semen kambing Peranakan Etawa dan Kambing Senduro yang ditandai dengan adanya pita tunggal dengan panjang 642 bp. Kambing persilangan etawa dan kambing Senduro memiliki kemiripan dengan spesies Capra hircus sehingga hasil PCR yang diperoleh homolog dengan amplifikasi fragmen DNA gen MC4R pada kambing Bligon berupa pita tunggal sepanjang 642 bp.
Hasil homologi PCR menunjukkan kemiripan genetik yang tinggi antar jenis kambing. Kemiripan genetik berbanding lurus dengan kemiripan fenotipe antara kambing persilangan Etawa dan kambing Senduro, sehingga perlu dilanjutkan dengan PCR-RFLP untuk analisis frekuensi genotipe.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi penurunan motilitas spermatozoa dari kambing peranakan Etawah dan kambing Senduro sebelum pembekuan dan pasca thawing semen beku dibandingkan dengan semen segar yang kemudian cocok digunakan untuk inseminasi buatan dan produksi embrio in vitro. Profil gen MC4R dapat dideteksi dari air mani dan semen beku serta terdapat homologi pada hasil PCR gen MC4R kambing peranakan Etawah dan kambing Senduro dengan kehadiran pita tunggal 642 bp.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementerian Pertanian Republik Indonesia yang mendanai penelitian ini melalui Nomor Beasiswa Tugas Belajar Dalam Negeri 323/KPTS/KP.320/A/05/2021. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Balai Pusat Inseminasi Buatan Singosari untuk memberikan izin mengumpulkan sampel.
Penulis : Prof. Dr. Budi Utomo, drh., M.Si. dan Ristaqul Husna Belgania (First and Corrisponding Author)
Research article:
Belgania RH, Utomo B, Mustofa I, Kholifah Y, Amrullah MF. 2023. Detection of Melanocortin Receptor Type 4 (MC4R) Gene in Semen of Etawah Crossbreed and Senduro Goats. 11:09
