Kultur sel Vero untuk produksi vaksin virus pada manusia telah umum dilakukan karena penggunaannya yang telah disetujui dan direkomendasikan oleh WHO. Umumnya kultur sel Vero membutuhkan media sebagai sumber nutrisi dengan suplementasi serum untuk meningkatkan pertumbuhan sel. Namun serum memiliki beberapa kekurangan. Maka dari itu pembuatan media bebas serum dengan penambahan epidermal grwth factor (EGF) dilakukan. Pada penelitian ini media SFM-EGF dibandingkan dengan media suplementasi serum yaitu MEM 10% dan MEM 5% FBS, morfologi dari sel diamati secara mikroskopis menggunakan mikroskop inverted dan proliferasinya dievaluasi menggunakan uji berbasis kalorimetrik MTT yang menghasilkan nilai berupa Optical Density (OD), pemeriksaan mikroskopis dan evaluasi proliferasi dilakukan setiap hari selama empat hari. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pemeriksaan mikroskopis dari hari pertama sampai keempat pada sel Vero E6 dan CCL81 tidak menunjukkan adanya perubahan morfologi pada sel. Proliferasi sel Vero E6 dan CCL81 pada media SFM-EGF pada hari pertama sampai ke empat tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap media suplementasi serum 10% maupun 5%. Hasil nilai OD dari sel Vero E6 dan CCL81 yang diberikan media SFM-EGF menghasilkan nilai rerata dibawah MEM 10% namun lebih tinggi dibandingkan MEM 5%. Sehingga melalui penelitian ini membuktikan bahwa pembuatan media bebas serum dengan penambahan EGF mampu meningkatkan proliferasi sel Vero E6 dan CCL81.
Pendahuluan
Continuous cell line Vero berasal dari sel epitel ginjal Monyet Hijau Afrika yang dikembangkan menjadi empat subtipe yaitu Vero JCRB0111, Vero CCL-81, Vero 76 dan Vero E6 (Shen et al., 2019, Konishi et al., 2022). Kultur sel Vero telah umum dilakukan karena penggunaannya yang telah disetujui dan direkomendasikan oleh WHO karena keamanannya untuk produksi vaksin virus manusia (WHO, 1998). Umumnya kultur sel Vero membutuhkan media sebagai sumber nutrisi dengan suplementasi serum untuk meningkatkan pertumbuhan sel. Pada serum mengandung faktor pertumbuhan, albumin, transferrin, faktor perlekatan, hormon dan mineral (Freshney et al., 2010). Namun penggunaan serum terbatas karena memiliki banyak kekurangan yaitu resiko akan kontaminasi dari agen infeksius seperti mycoplasma dan BSE, proses pembuatan yang tidak sesuai dengan kesejahteraan hewan, harga produksi serum tinggi, variasi antar batch yang tidak seragam sehingga menghasilkan hasil yang tidak konsisten hingga penggunaan serum yang dapat berimplikasi pada status keharaman atau kehalalan pada suatu produk (Hasyim et al., 2012). Kekurangan lain penggunaan serum dalam media kultur sel adalah terdapat laporan kasus reaksi alergi akan vaksin yang mengandung serum (Chruszcz et al., 2013). Seiring dengan kemajuan keilmuan dan teknologi juga terdapat banyak permintaan dari berbagai industri biofarmasetik untuk memproduksi asal bahan, bahan mentah maupun produk jadi yang bebas dari hewan atau animal component free (ACF) (Hasyim et al., 2012).
Maka dari itu upaya pembuatan dan pengembangan media bebas serum telah dilakukan. Namun, sampai saat ini belum ada media bebas serum yang secara umum dapat digunakan untuk semua sel karena pada setiap jenis sel terdapat perbedaan reseptor sel, tipe pertumbuhan dan diferensiasi sel yang berbeda-beda (Posung et al., 2021). Pembuatan media bebas serum (serum free media/SFM) merupakan salah satu alternatif pemilihan media yang bebas dari kandungan hewan sehingga lebih aman digunakan. Media bebas serum dapat ditambahkan beberapa kandungan lain seperti factor pertumbuhan EGF. EGF terdiri dari polipeptida tunggal dari 53 asam amino (Boonstra et al., 1995) yang merupakan faktor mitogenic yang dapat merangsang proliferasi berbagai jenis sel, terutama fibroblast dan sel epitel seperti sel Vero (Jung et al., 2008). Dengan menambahkan factor pertumbuhan seperti EGF pada media bebas serum (SFM-EGF), sel dapat tetap berproliferasi walaupun tanpa adanya serum (Posung et al., 2021).
Hingga saat ini penelitian terkait pembuatan media bebas serum dengan suplementasi EGF untuk kultivasi sel Vero masih sangat terbatas. Sehingga pada penelitian ini bertujuan untuk membuat media bebas serum dengan penambahan EGF yang dapat meningkatkan proliferasi sel Vero E6 dan CCL-81 yang akan diamati morfologi mikroskopis dan proliferasi pertumbuhannya.
Metodologi
E6 dan CCL-81 Vero Cell Culture
Kultur sel yang digunakan pada penelitian ini menggunakan sel Vero E6 (ATCC, USA) dan sel Vero CCL-81 (ATCC, USA) dari bank sel Research Centre for Vaccine Technology and Development, Institute Tropical Disease, Universitas Airlangga. Sel Vero E6 dan CCL-81 masing-masing dikultivasi sebanyak 2,1 x 106 pada T-flask 75 (Nest, China) yang di maintained in Minimum Essential Media (MEM; Gibco, New York) with supplementation 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Gibco, New York), 1% Amphotericin (Gibco, Israel) and 1% Penicillin Streptomycin (Gibco, New York) kemudian diinkubasi di inkubator (Thermo, New York) under 37°C in humidified environment with 5% CO2 condition.
Epidermal Growth Factor Treatment
Setelah sel mencapai sekitar 80% konfluensi, kemudian sel dikultivasi sebanyak 0,05 x 106 per well pada multiwell 24 (M24) (Nest, China) dengan media MEM 10% dan diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37°C dan 5% CO2 selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan penggantian media dengan berbagai media perlakuan MEM dengan suplementasi 10% FBS (MEM 10%), MEM dengan suplementasi 5% FBS (MEM 5% dan SFM-EGF dengan suplementasi EGF (SFM-EGF) (EGF; Biorad, USA). Sel kultur dimantain selama empat hari pada inkubator dengan suhu 37°C dan kadar CO2 5%, penggantian media dilakukan setiap 48 jam. Morfologi sel diamati setiap hari selama empat hari menggunakan mikroskop inverted (Invitrogen™ EVOS™ XL Core Configured Cell Imager; Invitrogen, USA) dengan perbesaran 100X.
Tetrazolium based colorimetric assay for cell proliferation
Cell proliferation assay dilakukan pada hari ke 1,2,3,4 dengan metode berbasis colorimetri MTT. Prinsip uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromida) berdasar pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh aktivitas mitokondria pada sel yang hidup (Präbst et al., 2017). Working solution MTT 5 mg/mL (Sigma-Aldrich, Netherlands) digunakan pada uji ini. Media kultur dibuang, dilanjutkan dengan pencucian menggunakan Dulbecco Phosphat Buffered Saline (dPBS; Gibco, New York) sebanyak 100µl kemudian ditambahkan reagen MTT working solution sebanyak 100µl dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37° dan kelembaban CO2 5%. Reagen MTT kemudian dibuang dan ditambahkan pelarut DMSO (Merck, USA) sebanyak 100µl kemudian dishaker dengan kecepatan 150 rpm dan dibaca pada ELISA Reader (Biobase, China) dengan Panjang gelombang 570 nm untuk mendapatkan hasil berupa Optical Density (OD).
Data analysis
Data penelitian ini disajikan dalam bentuk grafik dan gambar. Statistik parametrik digunakan apabila data penelitian memenuhi uji normalitas Kolmogorov-Smirnov dengan tiga ulangan teknis (n=3) yang digunakan pada penelitian ini. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS Statistic Versi 26. Untuk membedakan tiga atau lebih kelompok perlakuan, Uji F atau ANOVA digunakan dalam penelitian ini, apabila terdapat perbedaan antar kelompok dilanjutkan dengan post hoc test Uji Duncan. Signifikansi dicapai apabila nilai p < 0.05.
Study Period and Location
Penelitian dilaksanakan bulan Agustus sampai September 2023 yang dilakukan di Research Center for Vaccine Technology and Development (RCVTD) Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Surabaya.
Hasil dan Pembahasan
Pada penelitian ini, sel Vero E6 dan CCL-81 yang ditumbuhkan selama empat hari pada media bebas serum dengan penambahan EGF dibandingkan dengan media suplementasi serum yang umum digunakan yaitu MEM 10% dan MEM 5%. Hasil pemeriksaan mikroskopis selama empat hari tidak ditemukan adanya perbedaan morfologi dari sel Vero E6 dan CCL81. Kemudian hasil uji MTT pada media perlakuan SFM-EGF tidak menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap media suplementasi serum 10% maupun 5%. Sel Vero E6 dan CCL81 yang diberikan media SFM-EGF menghasilkan nilai rerata dibawah MEM 10% namun lebih tinggi dibandingkan MEM 5%. Sehingga dapat disimpulkan bahwa media SFM-EGF mampu meningkatkan proliferasi sel Vero E6 dan CCL81.
Pada pengamatan mikroskopis yang dapat dilihat pada Gambar 1a dan 1b, sel Vero E6 dan CCL81 yang diberi media SFM-EGF di hari pertama sampai hari keempat menunjukkan tidak adanya perubahan bentuk dibandingkan dengan MEM 10% dan MEM 5%. Hasil rata-rata OD disajikan pada Tabel 1. Hari pertama pada sel Vero E6 yang diberikan media SFM-EGF menunjukkan hasil yang berbeda nyata terhadap MEM 10% dan MEM 5%. Pada hari kedua, media SFM-EGF menunjukkan hasil berbeda signifikan (p < 0,05) dibandingkan dengan MEM 10% dan MEM 5%. Pada hari ketiga, media perlakuan SFM-EGF tidak menunjukkan hasil berbeda signifikan (p < 0,05) dibandingkan dengan MEM 10% dan MEM 5%. Pada hari keempat, media SFM-EGF menunjukkan hasil berbeda signifikan (p < 0,05) dibandingkan dengan MEM 10% dan MEM 5%.
Media merupakan sumber nutrisi untuk kultur sel. Media yang umum digunakan adalah media dengan penambahan serum. Salah satu nutrisi penting yang terkandung dalam serum adalah faktor pertumbuhan seperti platelet derived growth factor (PDGF), transforming factor beta (TGF-β), epidermal growth factor (EGF) yang menstimulasi pertumbuhan sel (Verma et al., 2022). Namun, penambahan serum pada media kultur memiliki banyak kekurangan seperti variasi antar batch yang tidak seragam sehingga menghasilkan produk hasil yang tidak konsisten, resiko akan kontaminasi agen infeksius, biaya yang mahal serta berimplikasi pada status kehalalan dari produk (Hashim et al., 2012). Maka dari itu dilakukan upaya dalam hal pengembangan pembuatan media bebas serum yang saat ini terus dilakukan (Posung et al., 2021). Untuk membuat media bebas serum, pada penelitian ini ditambahkan factor pertumbuhan EGF untuk menggantikan serum.
Epidermal Growth Factor (EGF) terdiri dari polipeptida 53 asam amino yang diisolasi dari kelenjar saliva tikus (Acosta et al., 2009). EGF dapat merangsang proliferasi berbagai jenis sel, terutama fibroblast dan sel epitel seperti sel Vero (Jung et al., 2008). EGF mempunyai efek mitogenik pada yang terbukti dapat merangsang sintesis mRNA, DNA dan protein sel (Acosta et al., 2009; Meybosch et al., 2019). Aktivitas biologis EGF bergantung pada ikatan spesifik pada sel membrane reseptor Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) yang nantinya merangsang proses biokimia yang menginisiasi siklus sel (Acosta et al., 2009). Pada penelitian ini penambahan media bebas serum dengan EGF
Kesimpulan
Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pembuatan media bebas serum dengan penambahan EGF mampu meningkatkan proliferasi dari sel Vero E6 dan sel Vero CCL-81 sehingga penggunaannya dapat menjadi alternatif media pengganti serum.
Penulis: Suryo Kuncorojakti, drh., M.Vet.
Baca juga: Semarak HUT ke-79 RI, UNAIR Gelar Lomba untuk Wariskan Tradisi
