Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit menular dengan insidensi, prevalensi, dan mortalitas yang tinggi secara global. Pengujian TB pada pusat pelayanan kesehatan, titik perawatan (point of care), yang akurat, murah dan mudah, menjadi kebutuhan bagi negara endemik TB untuk pengendalian penyakit yang mematikan ini secara global. Sensitivitas dan spesifisitas alat diagnostik komersial yang ada dipertanyakan karena hasil yang tidak konsisten dalam mendiagnosis TB. Selain itu, metode diagnostik TB terbaru memiliki beberapa keterbatasan. Metode kultur M. tuberculosis pada Löwenstein-Jensen atau BACTEC™ MGIT™ 960 diperlukan waktu lama, juga tes amplifikasi asam nukleat seperti GeneXpert MTB/RIF mahal. Selain itu, WHO (2015) tidak merekomendasikan penggunaan uji kulit tuberkulin (TST) dan uji pelepasan interferon-gamma (IGRA) untuk mendiagnosis TB aktif.

Selain itu, IGRA dan TST tidak dapat memprediksi risiko perkembangan TB seseorang. Respons imun pasien TB berpotensi sebagai pelacak perkembangan penyakit TB. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa orang tanpa gejala menghasilkan antibodi terhadap antigen Mycobacterium tuberculosis dalam jumlah kecil. Sebaliknya, pasien tuberkulosis aktif menunjukkan peningkatan titer antibodi. Oleh karena itu, deteksi profil respons imun pasien terhadap antigen M. tuberculosis berpotensi untuk mendiagnosis TB aktif, dan perkembangan TB dari infeksi tuberkulosis laten (LTBI). Infeksi bakteri dapat mengaktifkan imunitas seluler dan sekresi antibodi oleh sel plasma untuk melawan infeksi. Data sebelumnya menunjukkan bahwa pasien TB paru mengalami peningkatan titer imunoglobulin serum terhadap antigen bakteri M.tuberculosis, hanya sekitar 10% yang tidak menunjukkan peningkatan.

Namun, tes serologis yang berkembang sebelumnya memberikan hasil yang tidak konsisten dengan nilai sensitivitas dan spesifisitas yang sangat bervariasi. Dengan demikian, secara komersial tes serodiagnosis yang tersedia belum direkomendasikan untuk mendeteksi TB. Sementara itu, antibodi dapat digunakan untuk mendiagnosis sebagian besar penyakit infeksi menular. Selanjutnya, deteksi respons antibodi dapat dilakukan dengan cepat dan mudah dengan biaya yang murah. Ini berpotensi berguna di negara dengan beban TB tinggi jika sensitif dan akurat. IGRA, yang mendeteksi respons seluler, tidak praktis, memakan waktu, dan mahal, dengan penggunaan terbatas di negara dengan beban TB tinggi. Perlu diketahui mengapa deteksi antibodi, yang seharusnya diproduksi secara eksplisit melawan patogen, tidak digunakan untuk diagnosis TB yang akurat. Diketahui bahwa protein yang disekresi bersifat imunodominan karena langsung berinteraksi dengan sel imun tanpa gangguan bakteri.

Dalam penelitian ini, evaluasi respons antibodi terhadap protein asli yang disekresi utama dari M. tuberculosis, seperti Rv1860, Ag85C, PstS1, Rv2878c, Ag85B, dan Rv1926c, pada pasien TB paru dari RSUD Dr Soetomo, Surabaya, Indonesia. Penelitian ini fokus pada protein ini karena ditandai sebagai protein sekretori utama, sangat imunogenik atau merupakan komponen imunostimulator dari membran sel mikobakteri. Penelitian ini menemukan pentingnya penggunaan protein asli M. tuberculosis pada diagnosis TB berbasis antibodi.

Metode Penelitian

Karakteristik sampel, 59 sampel serum dari uji klinis positif dan bakteriologi positif dari kelompok pasien TB paru, dan 102 sampel serum dari kelompok control-orang sehat. Sebagian besar kelompok pasien ini berada pada rentang usia 55–64 (29%). Pada penelitian ini lebih banyak pasien wanita yang mengalami persentase yang lebih tinggi dibandingkan pasien laki-laki. Sekitar 61% pasien dari kelompok pasien ini adalah kasus baru, sekitar 25% pasien menderita pneumonia yang didapat dari komunitas (Community Acquired Pneumonia) sebagai penyakit penyerta. Skrining IgG pada serum pasien TB paru yang bereaksi terhadap protein yang disekresi oleh M. tuberculosis. Protein asli yang disekresi yaitu Rv1860, Ag85C, PstS1, Rv2878c, Ag85B, Rv1926c, dan turunan protein yang dimurnikan (PPD) dari kultur filtrat M. tuberculosis, dan dilakukan uji pengenalan dengan IgG dari sera pasien TB paru, menggunakan ELISA. Protein PPD sebagai kontrol, karena mewakili total filtrat biakan M. tuberculosis yang tidak aktif akibat panas.

Hasil Penelitian

Pada studi pendahuluan, dilakukan skrining serum dari 30 pasien TB paru dari 59 pasien TB paru, dan sejumlah yang sama dari kelompok orang sehat. Tingkat antibodi IgG kelompok pasien terhadap PPD, Rv1860, PstS1, Ag85B, dan Ag85C secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Titer antibodi IgG terhadap antigen Rv2878c dan Rv1926c tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok pasien dengan kelompok kontrol. Hasil statistik menunjukkan bahwa PPD, PstS1, Ag85B, dan Rv1860 berpotensi untuk digunakan sebagai antigen untuk serodiagnosis, menunjukkan sensitivitas, spesifisitas, PPV, dan NPV yang lebih tinggi dibandingkan dengan antigen yang lain.

Perbandingan antigen PstS1 dan Ag85B rekombinan dan asli, rekombinan dan ekspresi ePstS1 dan eAg85B yang dimurnikan dalam E. coli ClearColi®BL21. Namun, Rv1860 tidak berhasil diekspresi, kemungkinan karena kurangnya modifikasi pasca-translasi pada E. coli. Evaluasi respons IgG dari 30 pasien kelompok pasien dan kelompok kontrol, terhadap antigen PstS1 dan Ag85B rekombinan dan asli. Hasil menunjukkan bahwa titer antibodi IgG terhadap PstS1 dan Ag85B asli secara signifikan lebih tinggi pada kelompok pasien TB dari pada kelompok kontrol sehat. Sebaliknya, PstS1 dan Ag85B rekombinan tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara dua kelompok. Profil respons IgG antara 59 pasien TB paru dan 102 kontrol sehat terhadap tiga antigen.

Studi ini menemukan bahwa protein asli Rv1860, Ag85B, dan PstS1 bereaksi baik dengan IgG pasien TB paru. Penelitian lebih lanjut dengan memeriksa IgG terhadap protein asli Ag85B dan Rv1860 dalam jumlah subjek yang lebih banyak, 59 pasien TB paru dan 102 kontrol orang sehat. Konsentrasi antibodi terhadap Ag85B dan Rv1860 pada kelompok pasien secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Berdasarkan analisis statistik, Ag85B dan Rv1860 menunjukkan sensitivitas, spesifisitas, PPV, dan NPV yang lebih tinggi daripada antigen lainnya. Nilai kepekaan dari Ag85B dan Rv1860 masing-masing adalah 77,97% dan 62,71%. Sedangkan spesifisitas Ag85B dan Rv1860 berkisar 82,35% dan 93,41%.

Berdasarkan data tersebut dibuat diagram Venn untuk menggambarkan hubungan jumlah IgG antara Ag85B dan Rv1860. Diagram Venn menunjukkan bahwa pada kelompok pasien, sekitar 34 pasien positif untuk Ag85B dan Rv1860, dan dalam kombinasi menghasilkan sensitivitas 83%. Di samping itu, 81 orang dari kelompok kontrol dites negatif untuk kedua antigen tersebut, menghasilkan spesifisitas gabungan sebesar 79,4%. Tidak ada korelasi antara respons IgG dan tingkat keparahan pasien TB paru. Kelas keparahan pasien dalam penelitian ini ditentukan oleh skor TB Bandim.

Penilaian ini mengamati tanda dan gejala pasien untuk menentukan kelas keparahan TB paru. Data menunjukkan bahwa sebagian besar pasien memiliki gejala batuk dan sesak napas, sementara beberapa pasien memiliki BMI kurang dari 16 kg/m2. Berdasarkan catatan medis, pasien TB paru ditempatkan pada kelompok yang paling parah. Korelasi antara kelas keparahan dan respons IgG dianalisis dengan uji statistik Spearman. Hasil analisis Spearman menunjukkan tidak ada korelasi antara keparahan penyakit dan respons IgG pasien terhadap Ag85B dan Rv1860. Hasil ini menunjukkan bahwa tingkat IgG terhadap protein M. tuberculosis tertentu dapat membantu dalam deteksi TB. Tetapi tidak mencerminkan status penyakit TB pasien.

Pembahasan

Pengembangan diagnosis TB yang cepat dan akurat tetap menjadi tantangan saat ini. Diagnosis berdasarkan antibodi banyak digunakan untuk mendeteksi penyakit infeksi menular. Ini dapat diterapkan untuk diagnosis TB karena kecepatannya dan kesederhanaan, terutama di negara dengan beban TB tinggi dan berpenghasilan rendah, jika tingkat sensitivitas dan spesifisitasnya sama nilai yang dapat diterima. Selain itu, mengumpulkan sampel darah untuk deteksi antibodi lebih mudah daripada mengumpulkan dahak, karena pasien terkadang memiliki masalah mengeluarkan dahak. Pengembangan diagnostik berdasar deteksi antibodi dalam serum telah dilaporkan selama bertahun-tahun ini masih perlu penelitian lebih lanjut. Produk serodiagnosis dalam mendeteksi TB paru aktif masih kontroversial karena hasil yang bervariasi. Namun beberapa penelitian terdahulu mendukung hasil penelitian ini. Beberapa penelitian terdahulu membuktikan bahwa serodiagnosis memiliki potensi untuk melacak perkembangan penyakit TB dari infeksi tanpa gejala. Evaluasi kadar IgG terhadap protein yang disekresi dan dimurnikan dari M. tuberculosis dan mengkonfirmasi bahwa beberapa protein dikenali dengan baik oleh IgG yang diproduksi oleh pasien TB paru.

Antigen Ag85B dan Rv1860 memiliki nilai sensitivitas, spesifisitas, NPV, dan PPV terbaik dibandingkan dengan antigen lainnya, potensial sebagai target diagnostik. Hasil penelitian ini mengkonfirmasi peningkatan produksi antigen-spesifik antibodi pada pasien TB paru. Bertentangan dengan temuan ini, beberapa penelitian melaporkan bahwa protein rekombinan memberikan hasil sebagai biomarker untuk diagnosis TB. Tanpa diduga, pada temuan studi ini protein asli lebih baik dikenali oleh IgG dibandingkan dengan rekombinan yang diproduksi di E. coli.Hasil ini menunjukkan kemungkinan modifikasi pasca-translasi, khususnya terjadi pada M. tuberculosis, menentukan respons IgG terhadap protein asli protein sekretor M.tuberculosis.

Dilaporkan bahwa Rv1860 mengalami glikosilasi pada treonin pada posisi 27, dan modifikasi pasca translasi ini sangat penting dalam mengenali klon sel T-CD8 pada pasien LTBI. Protein yang dimodifikasi pasca-translasi ini dikenal sangat imunogenik. Dianggap bahwa respons imun yang mengenali modifikasi spesies-spesifik pada protein patogen lebih akurat mendeteksi patogen daripada pengenalan urutan protein sendiri, oleh karena itu, dapat menyebabkan respons host yang adekuat terhadap infeksi. Dengan demikian, rekognisi akurat oleh respons imun host sangat membantu untuk pengembangan metode diagnosis. LTBI merupakan sumber TB yang signifikan. Diagnosis TB berbasis antibodi yang tepat berpotensi mendeteksi tidak hanya penyakit aktif, tetapi juga risiko perkembangan TB dari LTBI.

Sebuah studi kohort longitudinal yang menyelidiki perubahan dalam IGRA dan tingkat antibodi di antara populasi LTBI di Indonesia, sedang dipertimbangkan sebagai kelanjutan dari penelitian ini. Korelasi antara tingkat keparahan yang ditentukan oleh Bandim TB dan respons IgG belum ada dilaporkan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa status gizi sangat penting dalam manifestasi klinis TB, mencari hubungan antara status gizi dan titer IgG diperlukan untuk penelitian ke depan. Penelitian ini berharap dapat memberikan manfaat informasi tentang pentingnya penggunaan protein asli untuk diagnosis TB berbasis antibodi. Penelitian selanjutnya tentang protein asli spesifik M. tuberculosis, seperti ESAT-6 dan CFP-10, mungkin berharga.

Berdasarkan hasil studi ini, disimpulkan pengujian antigen gabungan lebih akurat daripada tunggal, dapat menjadi strategi pengembangan uji serodiagnosis yang juga dapat memprediksi perkembangan TB. Di masa depan, kami berencana untuk membandingkan sensitivitas dan spesifisitas antara serodiagnosis dan IGRA pada kelompok TB aktif, infeksi tuberkulosis laten (LTBI), dan orang sehat. Selain itu, uji serologi juga diharapkan dapat mendukung diagnosis jenis TB lain yang sulit didiagnosis, seperti kasus TB paru BTA-negatif dan TB ekstra paru, termasuk pleuritis TB dan meningitis TB. Demikian penelitian tentang uji serologis pada diagnosis TB jenis ini dapat berharga untuk dikembangkan. Selain itu, penelitian lebih lanjut terhadap prediksi modifikasi pasca translasi pada protein M. tuberculosis juga penting untuk diselesaikan.

Kesimpulan

Studi ini mengungkapkan bahwa protein asli berkinerja lebih baik daripada protein rekombinan. Hasil penelitian ini menetapkan bahwa protein asli M. tuberculosis sangat penting sebagai kandidat diagnostik untuk tuberkulosis, menunjukkan antigen protein asli Ag85B dan Rv1860 dapat membedakan antara kelompok pasien TB paru dengan kelompok orang sehat.

Penulis: Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih, dr., MS, Sp.MK.
Informasi detail riset ini dapat dilihat pada link berikut ini: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39436-4 www.nature.com/scientificreports

Baca juga: Prof Fedik Uraikan Tantangan Pengembangan Vaksin Tuberculosis di 2nd ICITD