Teripang, Apostichopus japonicus merupakan salah satu sumber daya perikanan terpenting di negara-negara Pasifik barat laut (Liu, 2015). Karena permintaannya meningkat di negara-negara Asia, stok alami A. japonicus telah menurun secara dramatis selama beberapa dekade terutama karena eksploitasi yang berlebihan (Lin & Zhang, 2015). Oleh karena itu, pemerintah pusat dan daerah Korea telah mensponsori pelepasan benih buatan sejak tahun 2004 untuk memulihkan stok alaminya di sepanjang perairan pantai. Namun, restorasi buatan stok teripang oleh produksi pembenihan menimbulkan kekhawatiran mengenai keanekaragaman genetik yang berkelanjutan di antara populasi alami. Karena pengetahuan tentang struktur genetik sangat penting untuk pengelolaan ilmiah sumber daya ikan yang mempertahankan ukuran populasi dan keragaman genetik yang efektif (Abdul-Muneer, 2014), maka perlu untuk melacak keragaman genetik baik budidaya liar maupun budidaya teripang yang dilepasliarkan di sepanjang perairan pantai Korea.
Sebagian besar analisis genetik telah dilakukan dengan membandingkan urutan penanda genetik, yang diperkuat oleh reaksi berantai polimerase (PCR) dari DNA genom yang diekstraksi dari spesimen individu. Namun, metode-metode untuk menganalisis sumber daya genetik melalui penangkapan seringkali merusak organisme dan habitat, yang tidak diinginkan untuk tujuan pengelolaan sumber daya perikanan yang berkelanjutan (Bonar et al., 2009; Murphy & Willis, 1996). Analisis molekuler menggunakan sampel DNA lingkungan (eDNA) adalah pendekatan yang muncul untuk biomonitoring dengan sedikit dampak lingkungan selama pengumpulan sampel. Penelitian eDNA umumnya mengacu pada DNA ekstraseluler di lingkungan (sedimen, air, atau udara), yang telah dilepaskan dari kulit, lendir, air liur, sperma, sekresi, telur organisme (Bohmann et al., 2014; Goldberg et al., 2016). Sebagai alat yang hemat biaya dan sensitif, analisis eDNA telah digunakan dalam berbagai topik penelitian ekologi, termasuk keanekaragaman hayati (Evans et al., 2017), deteksi patogen (Bastos Gomes et al., 2017), spesies yang terancam punah atau invasif. deteksi (Rees et al., 2014), atau kesehatan dan dinamika ekosistem (Evrard et al., 2019).
Berdasarkan hasil penelitian ini, penelitian genetik teripang dapat dilakukan secara non-destruktif melalui metode analisis DNA lingkungan. Analisis genetik melalui metode pengumpulan tradisional membutuhkan waktu dan upaya yang relatif besar selama pengumpulan dan pengamatan sampel. Namun, metode yang baru dibuat dalam penelitian ini menggunakan eDNA memungkinkan untuk menyelidiki mereka dengan cepat memperoleh eDNA kira-kira dalam 1 menit untuk setiap sampel. Harga untuk setiap filter membran untuk mengamankan DNA lingkungan sekitar kurang dari $1 per potong, yang lebih efisien secara ekonomi daripada mengamankan teripang. Karena tingkat kematian di semua percobaan adalah 0, menunjukkan dampak yang kecil terhadap lingkungan daerah survei, yang mirip dengan penelitian sebelumnya (Yunwei et al., 2005). Setelah pengumpulan eDNA, individu dapat dilepaskan ke habitat yang menunjukkan bahwa metode ini dianggap sebagai metode penting untuk melindungi ekosistem daerah yang disurvei. Kami berhasil mengukur jumlah salinan teripang menggunakan qPCR dengan primer spesies spesifik pad gen inti sel dan mitokondria (AjaβActin dan AjaCOI). Di antara dua primer yang digunakan dalam penelitian ini, primer AjaCOI mengungguli AjaβActin. Nilai LOD (108,78 eksemplar) dan LOQ (814 eksemplar) dari primer AjaCOI berada dalam kisaran yang dapat diterima dari nilai LOD (2,19-26 eksemplar/reaksi) dan LOQ (6-839 eksemplar/reaksi) seperti yang disarankan dalam penelitian sebelumnya ( Klymus dkk., 2020). Namun, primer AjaβActin menunjukkan tingkat nilai LOQ yang relatif tinggi (3.174 eksemplar), menunjukkan sensitivitasnya yang rendah untuk analisis DNA nuklir. Hasil ini menunjukkan bahwa primer AjaβActin mungkin tidak cocok untuk pengukuran gen AjaβActin. Faktanya, ada banyak salinan gen aktin sitosol dalam teripang (Ortiz-Pineda et al., 2009), sulit untuk merancang set primer gen spesifik untuk gen aktin teripang. Namun, kualitas primer AjaβActin yang rendah tidak akan mengubah hasil kami karena beberapa alasan. Jumlah salinan dari semua sampel yang diperiksa dalam penelitian ini berkisar antara 15.676 hingga 11.344.190 eksemplar, jauh lebih tinggi dari LOQ. Oleh karena itu, sensitivitas AjaβActin tidak dianggap bermasalah dalam penelitian ini. Selain itu, tujuan primer AjaβActin adalah untuk memperkirakan jumlah salinan gen nuklear bukan gen aktin dan perkiraan jumlah salinan AjaβActin dengan templat konsentrasi LOQ yang jauh lebih tinggi berhasil mencerminkan jumlah salinan gen pada inti sel. Dalam penelitian ini, kami hanya memperkirakan jumlah salinan eDNA inti sel dan mitokondria dengan qPCR tetapi primer spesifik gen untuk setiap tujuan individu harus dievaluasi menggunakan nilai LOQ dan LOD. Meskipun ada banyak penelitian sebelumnya (Hoshino & Inagaki, 2012; Jo et al., 2020; Kwong et al., 2021) untuk mengukur DNA lingkungan, evaluasi setiap set primer akan menjadi penting untuk jumlah salinan eDNA yang rendah di sampel air. Oleh karena itu, sangat disarankan untuk menguji keandalan set primer dengan nilai LOD/LOQ yang tepat sebelum analisis kuantitatif (Thalinger et al., 2021).
Mempertimbangkan semua kondisi pretreatment yang diperiksa, kami di sini menetapkan protokol pretreatment standar untuk analisis eDNA teripang. Namun, kami di sini hanya menguji hasil DNA yang dipulihkan dari sampel air laut dan kemungkinan merusak kualitas eDNA selalu ada selama pengumpulan, pengiriman atau penyimpanan sampel air laut atau eDNA (Takahara et al., 2015; Yamanaka et al. , 2016). Meskipun kami disini menggunakan air laut buatan, hal ini mungkin tidak dapat diterapkan tergantung pada kondisi lapangan. Penggunaan air laut langsung dari lokasi sampel berimplikasi pada berbagai faktor eksternal seperti suhu, inhibitor, atau gen asing kontaminan, dll. Khususnya, masuknya perairan teritorial membawa berbagai komponen penghambat ke air laut selama musim hujan di Korea, yang akan menjadi salah satu perhatian utama pengumpulan air dari lokasi sampel (Zipper et al., 2003). Perhatian khusus juga harus dilakukan selama pengiriman atau penyimpanan sampel air laut atau eDNA. Eksperimen sebelumnya menunjukkan bahwa air harus disaring dalam waktu 24 jam setelah pengumpulan sampel (Hinlo et al., 2017) dan kami juga memiliki hasil yang serupa (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, penyaringan sampel air di tempat sangat dianjurkan di setiap tempat pengambilan sampel. Membran yang disaring dapat disimpan dalam tabung falcon (15 mL) yang berisi buffer lisis yang mencegah eDNA dari degradasi lebih lanjut. Suhu dan waktu penyimpanan juga mempengaruhi kualitas dan kuantitas eDNA yang dipulihkan dan beberapa bahan kimia seperti benzalkonium klorida telah terbukti efektif untuk menekan degradasi yang terkait dengan masalah penyimpanan dan pengiriman. Secara kolektif, kami di sini menetapkan protokol standar untuk mendapatkan eDNA teripang dari sampel air, yang akan membantu pengelolaan sumber daya A. japonicus secara ilmiah dan efisien dengan dampak kecil pada ekosistem laut di Korea.
Penulis: Dr. Eng. Sapto Andriyono
Tulisan lengkap dapat ditemukan pada
Kang, Y. A., Lee, S. R., Kim, E. B., Park, S. U., Lim, S. M., Andriyono, S., & Kim, H. W. (2022). Optimized pretreatment conditions for the environmental DNA (eDNA) analysis of Apostichopus japonicus. Fisheries and Aquatic Sciences, 25(5), 264-275.
DOI: https://doi.org/10.47853/FAS.2022.e24
link : https://www.e-fas.org/archive/view_article?pid=fas-25-5-264
