Proses detaching sangat penting pada tahapan kultur sel adherent karena dapat mempengaruhi viabilitas sel. Penggunaan arus listrik atau larutan washing merupakan tehnik yang umum untuk membantu proses detaching sel, sebelum tripsinasi. Tripsinasi adalah proses disosiasi sel menggunakan tripsin, yaitu suatu enzim proteolitik yang memecah protein, untuk memisahkan sel yang melekat dari tempat sel dibiakkan.
Tripsinasi merupakan tehnik populer untuk detach sel, meskipun memiliki kerugian yaitu dapat menurunkan viabilitas sel karena kerusakan pada membran dan matrik ekstraseluler. Beberapa peneliti melaporkan bahwa tripsin memiliki efek toksik jika diberikan terlalu lama dalam media, dan jika terkena cahaya fluoresen. Akhir-akhir ini terdapat beberapa metode untuk mempercepat proses tripsinasi yaitu melalui pemberian arus listrik DC. Penggunaan arus listrik DC akan menyebabkan perubahan ion Ca2+ dalam sel. Stimulus listrik, khususnya, dapat mempengaruhi sel yaitu sifat dan fungsi seperti adhesi, penataan dari sitoskeleton, proliferasi, faktor pertumbuhan dan gen ekspresi, dan viabilitas sel. Metode tripsinasi yang lain adalah penggunaan larutan pembilas seperti phosphate buffer saline (PBS) sesaat sebelum diberi tripsin, sehingga akan meningkatkan efektivitas kerja tripsin dan sel akan mudah lepas dari perlekatannya.
PBS adalah larutan penyangga biologis yang paling umum digunakan, dan merupakan larutan isotonik dan non-toksik terhadap sel, serta memiliki kemampuan menjaga osmolaritas. Oleh karena itu PBS cocok untuk proses pembilasan pada kultur sel. PBS merupakan larutan garam berbasis air yang mengandung dinatrium hidrogen fosfat, natrium klorida, dan dalam beberapa formulasi ada penambahan kalium klorida dan kalium dihidrogen fosfat. Namun demikian, penelitian lain menunjukkan bahwa penggunaan PBS secara klinis sebagai pembilasan mata menunjukkan bukti terjadi kalsifikasi kornea dikarenakan kandungan fosfat.
Larutan fisiologis sodium chloride (NaCl) 0,9% merupakan larutan fisiologis standar untuk berbagai keperluan penanganan sel atau jaringan hewan, dengan tujuan tetap mempertahankan aktivitas metabolisme sel. Penggunaan NaCl 0,9% sebagai pengencer sperma telah menunjukkan keberhasilannya dalam mempertahankan viabilitas sperma untuk proses fertilisasi.Di AS telah dikembangkan penggunaan media larutan penyimpanan berbasis kultur sel yang memungkinkan mempertahankan viabilitas sel untuk graft. Pada penelitian ini, tidak ada perbedaan yang signifikan pada kelangsungan hidup kondrosit antara media kultur berbasis MEM dan larutan penyimpanan berbasis ringer laktat (RL). Secara farmakologi, RL sama dengan cairan isotonik lainnya, yaitu untuk mengganti cairan pada kompartemen ekstraseluler.
Pentingnya proses tripsinasi dalam sistem kultur sel yang panjang, maka penelitian ini bertujuan untuk membandingkan efektivitas larutan washing phosphate buffer saline (PBS), sodium chloride (NaCl) dan ringer laktat (RL) terhadap kecepatan detaching dan viabilitas sel pada kultur sel fibroblas dan osteoblas.
Penelitian ini menggunakan dua cell line fibroblas BHK-21 C13 (Sigma, 85011433) dan osteoblas 7F2 (ATCC, CRL-12557). Sel BHK-21 C13 ditumbuhkan pada flask T75 dalam medium DMEM (Sigma, G5154), 2 mM glutamin (Gibco, 35050061), 5% tryptose phosphate Broth (Sigma, T8159), 10% FBS (Sigma, 12106C) dan 1% penisilin/streptomisin (Gibco, 15140122). Sel osteoblas 7F2 dikultur pada medium αMEM tanpa ribonucleosides, deoxyribonucleosides dan sodium bikarbonat (Sigma, M0894), ditambah 10% FBS dan 1% penisilin/streptomisin. Sel diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37oC, 5% CO2.
Efektivitas tripsinasi untuk detaching sel dapat ditingkatkan dengan cara membilas sel dengan larutan saline (PBS) sebagai kontrol, dan dibandingkan dengan larutan normal saline (NaCl 0.9%) dan ringer laktat (RL). Tampak bahwa fibroblas dan osteoblas di setiap kelompok dapat berkembang biak secara eksponensial berdasarkan pengukuran kepadatan sel. Pada kultur sel fibroblas dan osteoblas, penggunaan larutan PBS sebagai media pembilas tidak menyebabkan kerusakan membran sel yang ditandai dengan mortalitas dan gangguan proliferasi. Fibroblas dapat berproliferasi dan berkembang biak tanpa batas. Kemampuan fibroblas untuk berproliferasi berkurang pada kelompok yang dibilas dengan RL dibandingkan dengan sel osteoblas, meskipun perbedaan dalam jumlah sel tidak signifikan. Sedangkan pada kelompok NaCl tidak terdapat pengaruh dalam menumbuhkan sel fibroblas dan osteoblas. Penggunaan larutan fisiologis NaCl sebagai larutan pembilas dalam kultur sel, efektif dalam membantu mempercepat detaching sel, tanpa menggangu kemampuan proliferasi sel fibroblas dan osteoblas. Oleh karena itu, larutan NaCl dapat digunakan sebagai alternatif, jika peneliti kesulitan mendapatkan PBS, selain murah dan mudah didapat.
Penulis: Dr. Hendrik Setia Budi, drg., M.Kes.
Informasi detail dari riset ini dapat dilihat pada tulisan kami di:
https://www.scielo.br/j/bjb/a/FGGFhf96dhjdwHcQgFXZ5kw/abstract/?lang=en
Budi HS, Setyawati MC, Anitasari S, Shen YK, Pebriani I, Ramadan DE. Cell detachment rates and confluence of fibroblast and osteoblast cell culture using different washing solutions. Brazilian Journal of Biology. 2023 Jan 23;84.
