Salah satu kelemahan utama dalam ekspresi enzim Plasmodium Dehydrogenase (pLDH) menggunakan inang Escherichia coli adalah tingkat kelarutan yang rendah dan pembentukan badan inklusi (inclusion body). Menghasilkan enzim pLDH dengan kelarutan tinggi sangat penting untuk bahan pembuatan tes diagnostik cepat imunokromatografi (RDT) maupun untuk riset imunisasi. Oleh karenanya banyak peneliti melakukan modifikasi pada metode budidaya bakteri inang untuk meningkatkan kelarutan pLDH yang dihasilkan dengan E. coli. Penelitian ini dimulai dengan mengamplifikasi gen pengkode enzim pLDH dari sampel darah pasien yang terinfeksi malaria dan disambung dengan vektor pBlueScript II KS+ untuk memudahkan pembacaan urutan DNA (sekuensing). Setelah itu, gen pLDH diklon ke vektor pColdTF untuk ekspresi. Plasmid rekombinan yang dihasilkan (pCold-pLDH) ditransformasikan ke E. coli BL21 (DE3) strain kodon plus RIPL. Kemudian, bakteri pembawa plasmid rekombinan tersebut dikultur pada suhu 37°C sampai mencapai kepadatan (OD) pada 600 nm: 0,5. Setelah itu, suhu kultur diturunkan menjadi 15°C, diikuti dengan penambahan 0,1 mM IPTG ke dalam media kultur untuk induksi ekspresi pLDH. Setelah itu, inang bakteri dikultur dalam bioreaktor shaker dingin (15°C).
Ekspresi protein rekombinan pada E. coli BL21 (DE3) strain kodon plus RIPL dapat meningkatkan kelarutan rekombinan protein. Hak ini disebabkan karena sel-sel bakteri memiliki tambahan gen penyandi tRNA seperti ileY, argU, proL, dan leuW. Oleh karena itu, ekspresi protein target menggunakan inang dengan 11% kandungan gen tRNA langka dapat berlangsung secara efisien. Selain itu, penggunaan suhu dingin (15°C) dengan jumlah IPTG yang rendah (0,1 mM) telah dijelaskan dapat mengurangi pertumbuhan sel inang, memperlambat transkripsi dan tingkat translasi, serta mengurangi kekuatan interaksi hidrofobik sehingga mengurangi dihasilkannya protein salah lipat. Untuk itu, kombinasi dari dua pendekatan ini dapat digunakan untuk menghasilkan protein rekombinan dengan kelarutan tinggi.
Hasilnya uji coba menunjukkan bahwa kombinasi dari kultur inang pada suhu rendah (15°C) dengan kandungan IPTG yang rendah dapat meningkatkan kelarutan pLDH. Hasil ini menunjukkan bahwa protokol ini dapat menjadi metode untuk meningkatkan protein rekombinan berkualitas tinggi pada E. coli. Dengan demikian, protokol ini dapat menjadi solusi yang baik untuk mengatasi beberapa masalah tentang produksi pLDH yang tidak larut dengan aktivitas rendah pada ekspresi yang menggunakan inang E.coli.
Penulis: Muhamad Amin
Sumber: https://journal.ipb.ac.id/index.php/hayati/article/view/40340
