Jaringan gingiva merupakan sumber human gingival-derived mesenchymal stem cells (hGMSCs), yang mudah didapat dan tidak menyebabkan terjadinya morbiditas saat mengambil jaringan gingiva. hGMSC merupakan sumber unik untuk mesenchymal stem cells (MSC) yang merupakan bahan potensial untuk aplikasi pada tissue engineering dan terapi regeneratif. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak penelitian berfokus pada terapi baru tanpa menggunakan sel tetapi dengan sekretom yang diperoleh dari hGMSCs.
Terapi bebas sel dengan menggunakan sekretom memiliki beberapa keunggulan dibandingkan terapi berbasis sel, termasuk kemudahan penyimpanan dan penanganan, imunogenisitas yang lebih rendah, dan biaya yang lebih rendah untuk memastikannya utilitas dan kelayakan di klinik.3-4 Penanganannya produk rahasia hGMSC merupakan tantangan yang berat, dan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan komposisi dan sifat sekretomnya. Oleh karena itu, karakterisasi produk secretome hGMSC perlu dilakukan memastikan reproduktifitas unik hGMSC dalam prosedur penanganan dan mengevaluasi kemanjuran produk unik hGMSC dalam rekayasa jaringan periodontal dan terapi regeneratif.
Secretome adalah produk bioteknologi termolabil, jadi tidak dapat dikeringkan dengan metode termal karena dapat terdegradasi komponen bioaktifnya. Proses liofilisasi menggunakan metode pengeringan beku diharapkan dapat menjaga keutuhan fungsional dan struktural sekretom hGMSC. Proses liofilisasi sangat membantu dalam mengurangi laju degradasi dan menjaga mutu produk sekretom sehingga produk sekretom mempunyai umur simpan yang lebih lama.5 Sekretomnya diketahui kurang imunogenik dibandingkan dengan MSC, sehingga dapat digunakan sebagai terapi bebas sel yang dapat mendorong pemulihan fungsional berbagai cedera jaringan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan protein total, aktivitas antioksidan, dan kemampuan perlindungan lyophilized hGMSC yang diinduksi H2O2 secara in vitro.
Metode dan bahan
Kelompok penelitian dibagi menjadi kelompok kontrol (media kultur) dan kelompok perlakuan lyosecretome (0.0; 0.157, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5, dan 10 mg/mL + H2O2). Total protein secretome dan lyosecretome adalah ditentukan dengan uji bicinchoninic acid assay (BCA). Berat molekul protein secretome dan lyosecretome ditentukan dengan metode sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Sel osteoblas calvarial tikus pada passage 3 (Code: rOb-P3) dikultur dalam media kultur T75 hingga mencapai 80% confluency.
Berdasarkan uji BCA, secretome dan lyosecretome hGMSC tidak memiliki perbedaan signifikan dalam konsentrasi total protein (P ¼ 0,971). Dengan pengamatan menggunakan SDS-PAGE Protein di dalamnya secretome memiliki lima pita dengan berat molekul 171, 74, 64, 56, dan 26 kDa, sedangkan protein pada lyosecretome juga memiliki lima pita dengan berat molekul 174, 74, 61, 55, dan 26 kDa. Aktivitas lyosecretome disbanding Radikal ABTS secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan aktivitas antioksidan ascorbic acid (P <0,05). Ascorbic acid memiliki aktivitas antioksidan tertinggi sebesar 99,82 0,09% pada konsentrasi 0,006 mg/ml, dengan nilai IC50 sebesar 0,0018mg/ml.
Seckretom MSCs menstimulasi MSCs yang berada di jaringan untuk berproliferasi dan mengekspresikan penanda osteoblas yang lebih tinggi, menghasilkan mineralisasi jaringan baru dengan pembentukan rabekula baru.6,7 Sekretom MSC mudah diisolasi dari sel supernatan kultur dan diformulasikan menjadi sediaan freeze-dried.8 Penelitian ini meneliti kapasitas unik hGMSCs, dikenal sebagai lyosecretome untuk melindungi osteoblas calvarial tikus dari efek buruk oksidatif yang diinduksi H2O2. Secretome dan lyosecretome mengandung biomolekul, terutama protein, yang sangat sensitive terhadap sifat fisik dan pengaruh kimia sehingga terjadi proses denaturasi mengakibatkan perubahan pada struktur dan aktivitasnya.8 Protein yang mengandung sekretom harus disimpan pada suhu rendah berkisar antara -20 C sampai -80 C atau disimpan dalam sediaan freeze dried dengan proses liofilisasi untuk menjaga kandungan protein tanpa kehilangan fungsinya.9 Proses liofilisasi mengubah sekretom menjadi lyosecretome dengan penambahan krioprotektan, lalu freeze-dried. Mannitol, sebagai agen krioprotektan, berperan aberperan dalam mencegah kerusakan partikel protein selama proses liofilisasi.10 Penelitian ini telah membuktikan liofilisasi sekretom yang diperoleh dari hGMSC menjadi lyosecretome mampu mempertahankan kandungan proteinnya
Secara fungsional, lyosecretome ini berperan dalam berbagai proses biologis seperti respon imun, metabolisme sel, respons stres, dan pemeliharaan sitoskeleton. Dalam penelitian ini, protein dalam sekretom dan lyosecretome yang diperoleh dari hGMSC diperkirakan memiliki jenis protein seperti α-2-makroglobulin, Fa1p, peptide protein pengikat 72/74, a-(1,4)-glukosidase, heat shock cognate protein 71 kDa, ekstraseluler matriks protein-1, α-tubulin, dan chymotrypsinogen.11-13 Hidrogen peroksida adalah zat pengoksidasi kuat yang dapat menginduksi sel untuk memproduksi ROS dalam jumlah besar. Kadar H2O2 yang tidak normal menghambat diferensiasi sel dan menyebabkan sel apoptosis atau nekrosis.14 Stres oksidatif, akibat pembentukan ROS yang berlebihan, telah terbukti merusak berbagai komponen seluler osteoblas dan telah disarankan sebagai faktor awal yang penting untuk gangguan pembentukan tulang osteoblastik.15
Simpulan, penelitian ini menegaskan bahwa hGMSCs-lyosecretome memiliki aktivitas antioksidan sebesar 93,51 0,37%, dan hGMSCs-lyosecretome dengan konsentrasi 1,25 mg/ml mampu melawan stres oksidatif yang diinduksi H2O2. Oleh karena itu, hGMSCslyosecretome berpotensi sebagai terapi berbasis sekretom untuk mengobati beberapa penyakit tulang. Studi masa depan diperlukan untuk memvalidasi efek hGMSCs-lyosecretome di jaringan osteogenik dengan menggunakan model stres oksidatif tikus.
Penulis: Prof. Dr. Chiquita Prahasanti S, drg., Sp.Perio.
