Escherichia coli merupakan sel inang yang banyak digunakan untuk memproduksi protein rekombinan karena selnya dapat tumbuh dengan cepat dan mudah direkayasa secara genetika, sistem ekspresinya sudah diketahui dengan baik, serta protein target dapat diekspresikan dalam jumlah besar, sehingga terbilang efektif dari segi biaya produksi. E. coli juga telah disetujui sebagai salah satu sel inang untuk memproduksi obat biologi bagi manusia. Dalam kurun waktu yang lama E. coli telah menjadi sistem ekspresi yang mampu memproduksi sebagian besar protein terapeutik generasi pertama dan sampai saat ini masih menjadi salah satu pilihan yang perlu dipertimbangkan dalam pengembangan protein rekombinan.
Pada pengembangan bioproses hulu dari protein rekombinan, fermentasi di laboratorium meliputi skrining pada labu Erlenmeyer dan fermentor pada skala kecil. Fermentasi di labu Erlenmeyer dilakukan untuk memastikan kesesuaian sistem ekspresi dan ekstraksi protein di proses hilir sehingga dapat diperoleh protein target yang diharapkan. Sementara itu, pengembangan proses di fermentor dilakukan untuk mengoptimalkan pertumbuhan bakteri dan ekspresi protein sehingga menghasilkan jumlah titer protein yang tinggi menggunakan strategi high cell density cultivation (HCDC). Strategi kultivasi ini dapat dicapai dengan pertumbuhan bakteri yang konstan pada kecepatan tinggi menggunakan media kultur kaya nutrisi dan penjagaan tingkat aerasi yang tinggi. Sayangnya kondisi semacam itu dapat menciptakan stres lingkungan bagi sel akibat adanya akumulasi metabolit sekunder yang bersifat toksik atau pun peningkatan viskositas dan osmolaritas media.
E. coli merespon perubahan lingkungan yang terjadi di sekitarnya tersebut secara cepat. Respon tersebut harus diantisipasi ketika dilakukan pengembangan strategi fermentasi untuk tujuan komersial. Respon yang terjadi kemungkinan menandakan perubahan dalam fisiologi sel, yang mana sangat penting dalam pertumbuhan sel dan tingkat produksi protein target. Respon utama bagi sel E. coli melibatkan regulasi ekspresi protein membran luar (Omp) yang menjadi bagian dari pertahanan sel dan lalu lintas keluar masuknya molekul dari dan ke dalam sel. Tingkat ekspresi dari protein membran luar, baik itu OmpA, OmpC, dan OmpF berbeda-beda bergantung dari galur E. coli maupun perubahan lingkungan yang terjadi. Suatu studi menunjukkan bahwa tingkat ekspresi OmpA lebih tinggi terjadi di E. coli galur K-12 dibandingkan galur B. Keduanya merupakan galur E. coli yang umum digunakan pada produksi protein rekombinan.
Pada strategi HCDC yang mana pertumbuhan bakteri dijaga pada level yang tinggi, terdapat kemungkinan ekspresi OmpA yang lebih tinggi pula. Meskipun demikian, studi mengenai efek dari strategi fermentasi ini pada ekspresi OmpA belum dilaporkan.
Dalam penelitian yang dilakukan oleh dosen dari Departemen Kimia FST UNAIR dan tim peneliti dari Dexa Laboratories of Biomolecular Sciences (DLBS) PT. Dexa Medica menggunakan E. coli BL21 (galur B) yang dapat mengekspresikan insulin rekombinan dari manusia, ditemukan bahwa terjadi peningkatan ekspresi protein membran luar A (OmpA) selama serangkaian proses fermentasi. Peningkatan tersebut terjadi pada fermentasi menggunakan labu Erlenmeyer, fermentor 1 Liter, hingga fermentor 10 Liter. Ekspresi protein OmpA terjadi secara bersamaan seiring dengan pertumbuhan bakteri. Hal tersebut teramati pada awal dari fase eksponensial. Pengukuran terhadap densitas sel selama fermentasi dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Sementara itu, konfirmasi terhadap ekspresi dari OmpA dilakukan dengan beberapa metode, yaitu SDS-PAGE, Gel Analyzer, Western Blot, dan LC-MS/MS. Dengan serangkaian metode tersebut, terkonfirmasi bahwa spesi berukuran sekitar 35 kDa yang ditemukan adalah OmpA.
Peristiwa meningkatnya ekspresi OmpA selama proses fermentasi menyebabkan ekspresi protein target menjadi lebih rendah. Akibatnya, terjadi penurunan efisiensi proses produksi protein rekombinan pada E. coli. Meskipun menjadi kekurangan dalam pengembangan bioproses, fenomena tersebut justru menginspirasi tim peneliti untuk melakukan pengamatan secara intens terhadap ekspresi dari OmpA sebagai salah satu indikator mengenai respon E. coli terhadap kondisi fermentasi. Pemeriksaan tambahan ini akan mencegah peningkatan ekspresi OmpA yang dapat menyebabkan ekspresi protein target menjadi lebih rendah.
Strategi yang direkomendasikan untuk mengatasi peningkatan ekspresi OmpA pada fermentor 1 L adalah perlunya dilakukan sterilisasi glukosa secara terpisah dari komponen media lain selama proses penyiapan. Selain itu, volume awal dari media yang digunakan untuk fermentasi harus dijaga lebih dari 30% dari kapasitas kerja fermentor. Pada fermentor 10 L, rekomendasi tersebut juga dapat diadopsi, hanya saja volume awal media yang digunakan perlu ditingkatkan setidaknya hingga 50%. Hal ini mengindikasikan perlunya penyesuaian dalam pengoperasian fermentasi ketika terjadi pengembangan pada skala yang lebih tinggi.
Penulis: Fatiha Khairunnisa
Informasi detail terkait penelitian ini dapat ditemukan pada publikasi berikut:
Kurnia, F., Novirani, G., Khairunnisa, F. et al. An elevated OmpA expression during the production of a recombinant protein in Escherichia coli. Braz J Microbiol 54, 2755–2763 (2023). https://doi.org/10.1007/s42770-023-01152-6
