Sel punca mesenkimal manusia (human mesenchymal stem cells; hMSC) merupakan sumber daya utama dalam bidang kedokteran regeneratif karena memiliki kemampuan memperbarui diri (self-renewal) serta potensi diferensiasi multipoten. Namun, penerapan pada skala klinis memerlukan jumlah sel yang jauh melebihi kapasitas yang dapat diperoleh langsung dari jaringan donor, sehingga diperlukan metode ekspansi ex vivo yang efisien dan andal. Sistem kultur dua dimensi (2D) konvensional masih banyak digunakan, tetapi belum mampu memenuhi kebutuhan tersebut. Sistem ini secara inheren memiliki keterbatasan dalam hal skalabilitas karena bergantung pada perluasan luas permukaan kultur, sehingga membatasi produktivitas volumetrik. Selain itu, kultur jangka panjang pada kondisi tersebut sering kali menyebabkan penurunan hasil panen sel, peningkatan senesens seluler, serta hilangnya sifat multipotensi, yang pada akhirnya menurunkan kualitas dan efektivitas terapeutik hMSC.

Sebagai alternatif, sistem berbasis bioreaktor telah berkembang sebagai platform kultur yang lebih mudah terukur (scalable) untuk menggantikan platform kultur konvensional. Sistem ini menawarkan kontrol yang lebih baik terhadap berbagai parameter kultur, seperti pH, kadar oksigen terlarut, dan suplai nutrisi. Karakteristik tersebut memungkinkan proses ekspansi sel yang lebih konsisten dan efisien, sehingga sangat menguntungkan untuk aplikasi manufaktur berskala besar maupun produksi klinis. Di antara berbagai pendekatan tersebut, kultur berbasis microcarrier menjadi salah satu strategi yang paling menjanjikan karena menyediakan luas permukaan yang besar bagi pertumbuhan sel yang bergantung pada perlekatan (anchorage-dependent cells) dalam volume kultur yang relatif kecil, sehingga memungkinkan tercapainya densitas sel yang tinggi secara efisien. Selain itu, sistem microcarrier dapat dengan mudah diintegrasikan ke dalam bioreaktor tipe stirred-tank, sehingga mendukung terciptanya lingkungan kultur yang terukur dan homogen. Meskipun demikian, reproduksibilitas dan pencapaian ekspansi hMSC yang dapat direproduksi (reproducible) dan berproduksi tinggi (high-yield) masih menjadi tantangan, terutama karena sulitnya mengendalikan proliferasi sel sekaligus mempertahankan karakteristik sel punca selama proses kultur di dalam bioreaktor.

Faktor pertumbuhan (growth factors) memegang peran penting dalam mengatur proliferasi serta mempertahankan  sifat fungsional hMSC. Basic fibroblast growth factor (bFGF) telah lama dikenal memiliki kemampuan untuk meningkatkan proliferasi sel, mempertahankan karakteristik stemness, serta menunda senesens seluler. Selain meningkatkan efisiensi ekspansi, bFGF juga berkontribusi dalam mempertahankan keadaan hMSC agar tidak terdiferensiasi (undifferentiated state) selama kultur in vitro. Di sisi lain, insulin-like growth factor-1 (IGF-1) berperan dalam menstimulasi proliferasi sel serta mengatur metabolisme dan diferensiasi tulang. Jalur sinyal IGF-1 juga dikaitkan dengan peningkatan viabilitas sel (survival) dan aktivitas metabolik sel. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa stimulasi menggunakan kombinasi beberapa faktor pertumbuhan mampu memodulasi proliferasi dan komitmen diferensiasi (lineage commitment) hMSC secara sinergis, sehingga menegaskan pentingnya koordinasi persinyalan dalam mengoptimalkan ekspansi dan fungsi sel.

Pada penelitian kami sebelumnya, kami mengimobilisasi bFGF pada microcarrier berlapis kolagen dan berhasil meningkatan ekspansi hMSC. Berdasarkan strategi tersebut, penelitian ini memperkenalkan desain protein fusi kimera yang menghubungkan domain IGF-1 dan bFGF melalui collagen-binding peptide (CBP) yang berasal dari osteopontin. Pendekatan molekul tunggal ini menjamin rasio molar yang tetap serta presentasi spasial yang seragam dari kedua domain, suatu keunggulan yang tidak dapat dicapai melalui ko-imobilisasi protein secara terpisah. Protein kimera diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan, kemudian dikombinasikan dengan microcarrier poli(vinil alkohol) (PVA) berlapis kolagen tipe I untuk menghasilkan microcarrier terimobilisasi protein kimera. Selanjutnya, hMSC dikultur pada microcarrier tersebut dan dievaluasi potensinya dalam meningkatkan diferensiasi osteogenik.

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa koperesentasi stoikiometri IGF-1 dan bFGF pada collagen-based scaffold menawarkan pendekatan yang reproduktif (reproducible) dan terukur (scalable) untuk ekspansi hMSC. Selain itu, penelitian ini memberikan pemahaman mengenai bagaimana topologi faktor pertumbuhan memperngaruhi perilaku sel. Dalam penelitian ini, hMSC diekspansi pada microcarrier PVA yang difungsionalisasi dengan empat jenis konstruksi protein. CBP digunakan untuk menghubungkan domain IGF-1 dan bFGF pada microcarrier PVA berlapis kolagen, sehingga menghasilkan imobilisasi protein kimera yang stabil. Pada seluruh kondisi yang diuji (IICF, ICF, CF, dan CI), jumlah sel yang diperoleh lebih tinggi dibandingkan microcarrier PVA berlapis kolagen tanpa protein, dengan ICF menghasilkan jumlah sel tertinggi, diikuti oleh IICF. Dalam waktu 10 hari, hMSC yang dikultur pada microcarrier terikat ICF mengalami peningkatan ekspansi sekitar 1,31 kali lipat dibandingkan dengan microcarrier terikat CF, serta 3,10 kali lipat dibandingkan microcarrier terikat CI. Temuan tersebut menunjukkan bahwa imobilisasi beberapa growth factor pada microcarrier menghasilkan jumlah sel yang lebih besar dibandingkan dengan microcarrier yang diimobilisasi dengan growth factor tunggal.

Menariknya, ICF menunjukkan performa yang lebih unggul dibandingkan dengan IICF, meskipun IICF membawa dua salinan IGF-1. Duplikasi tandem pada IICF kemungkinan menimbulkan hambatan sterik (steric hindrance). Hal ini kemungkinan terjadi karena posisi domain IGF-1 di bagian luar pada IICF dapat mengganggu akses reseptor terhadap domain bFGF. Sebagai alternatif, koperesentasi yang seimbang antara domain IGF-1 dan bFGF dapat menghasilkan pola aktivasi reseptor yang berbeda dibandingkan konstruksi yang mengandung duplikasi domain IGF-1.

Keunggulan konseptual utama dari strategi ini terletak pada fusi IGF-1 dan bFGF menjadi satu protein kimera. Desain tersebut menjamin kedua domain growth factor disajikan pada rasio molar yang tetap (1:1 pada ICF, 2:1 pada IICF) di permukaan microcarrier, sekaligus memberikan kontrol stoikiometri yang presisi. Sebaliknya, apabila masing-masing protein diimobilisasi secara terpisah, jumlah relatif protein pada permukaan tidak dapat dikontrol secara presisi akibat perbedaan kinetika adsorpsi dan hambatan sterik.

Bahkan jika reaksi imobilisasi diawali dengan campuran protein pada rasio tertentu, komposisi akhir protein pada permukaan dapat menyimpang dari rasio awal tersebut. Kuantifikasi yang akurat akan membutuhkan metode yang secara teknis lebih kompleks, seperti radiolabeling atau enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), yang kurang praktis untuk penggunaan rutin. Oleh karena itu, penggunaan protein kimera menawarkan keunggulan yang unik dalam menjamin penyajian beberapa berbagai domain bioaktif secara terukur pada substrat rekayasa.

Secara kolektif, hasil penelitian ini membuktikan bahwa penggunaan protein kimera berbasis CBP untuk mengimobilisasi domain IGF-1 dan bFGF pada microcarrier PVA merupakan strategi yang menjanjikan untuk ekspansi hMSC yang terukur (scalable). Dengan memastikan stoikiometri berbagai growth factor serta koordinasi persinyalan reseptor, metode ini mampu meningkatkan proliferasi hMSC secara cepat dan efisien sekaligus mempertahankan potensi diferensiasinya. Karakteristik tersebut menunjukkan potensi besar untuk diaplikasikan dalam bidang kedokteran regeneratif dan terapi berbasis sel.

Authors:

Shiina Pasanen, Fumika Abe, Karina Erda Saninggar, Isao Hirata, Kotaro Tanimoto, dan Koichi Kato

ACS Omega, Mei 2026

Link DOI: https://doi.org/10.1021/acsomega.6c01367